Isositrat dehidrogenase memangkinkan tindak balas kimia berikut:

Isositrat + NAD+ ⇌ {\displaystyle \rightleftharpoons } 2-oksoglutarat + CO2 + NADH + H+Isositrat + NADP+ ⇌ {\displaystyle \rightleftharpoons } 2-oksoglutarat + CO2 + NADPH + H+[9][10][11]

Tenaga bebas keseluruhan untuk tindak balas ini ialah -8.4 kJ/mol.[12]

Mekanisme pemangkinan pecahan isositrat kepada oksalosuksinat, dan seterusnya produk akhir, alfa-ketoglutarat. Perantaraan oksalosuksinat ialah hipotesis; ia tidak pernah diperhatikan dalam versi penyahkarboksilan enzim.[13]

Langkah-langkah

Dalam kitaran asid sitrik, isositrat yang dihasilkan daripada pengisomeran sitrat mengalami pengoksidaan dan penyahkarboksilan. Enzim isositrat dehidrogenase (IDH) memegang isositrat dalam tapak aktifnya dengan asid amino di sekelilingnya, termasuk arginina, tirosina, asparagina, serina, treonina dan asid aspartik.

Dalam rajah yang disediakan, kotak pertama menunjukkan tindak balas dehidrogenase isositrat keseluruhan. Bahan tindak balas yang diperlukan untuk mekanisme enzim ini ialah isositrat, NAD+ / NADP+, dan Mn2+ atau Mg2+. Hasil tindak balas ialah alfa-ketoglutarat, karbon dioksida, dan NADH + H+ / NADPH + H+.[10] Molekul air membantu menyahprotonkan atom oksigen isositrat.

Kotak kedua dalam rajah menggambarkan langkah 1 tindak balas, iaitu pengoksidaan alfa-karbon (C2 di sini, juga dipanggil alfa-C).[9][10] Dalam proses ini,[9] kumpulan alkohol alfa-karbon dinyahproton, dan pasangan elektron tunggal yang terhasil membentuk kumpulan keton pada karbon tersebut. NAD+/NADP+ bertindak sebagai kofaktor penerima elektron dan mengumpul hidrida yang terhasil daripada C2. Pengoksidaan karbon alfa memperkenalkan susunan molekul di mana elektron (dalam langkah seterusnya) akan mengalir dari kumpulan karboksil berdekatan, dan menolak elektron oksigen terikat berganda naik ke atas atom oksigen itu sendiri yang menarik proton daripada lisina berdekatan.

Kotak ketiga menggambarkan langkah 2, iaitu penyahkarboksilan oksalosuksinat. Dalam langkah ini,[9][10] oksigen kumpulan karboksil dinyahproton oleh tirosina berdekatan, dan elektron tersebut mengalir ke C2. Karbon dioksida, kumpulan keluar, terlepas daripada karbon beta isositrat (C3), dan elektron mengalir ke oksigen keton yang melekat di karbon alfa, memberikan cas negatif kepada atom oksigen yang berkaitan lalu membentuk ikatan berganda tak tepu alfa-beta antara karbon 2 dan 3.

Kotak keempat dan terakhir menggambarkan langkah 3, iaitu penepuan ikatan berganda tak tepu alfa-beta yang terbentuk dalam langkah sebelumnya. Oksigen bercas negatif (yang melekat pada alfa-karbon) menderma elektronnya, mengubah ikatan berganda keton dan menolak pasangan tunggal lain (yang membentuk ikatan ganda dua antara karbon alfa dan beta) "keluar" molekul. Pasangan tunggal ini pula mengambil proton daripada tirosina berhampiran.[14] Tindak balas ini menghasilkan pembentukan alfa-ketoglutarat, NADH + H+/NADPH + H+, dan CO2.

Mekanisme terperinci

Dua sisa asid amino aspartat (di bawah kiri) berinteraksi dengan dua molekul air bersebelahan (w6 dan w8) dalam kompleks IDH babi isositrat Mn2+ untuk menyahproton alkohol daripada atom alfa-karbon. Pengoksidaan alfa-C juga berlaku dalam gambar ini, di mana NAD+ menerima hidrida yang menghasilkan oksalosuksinat. Bersama dengan perubahan stereokimia sp3 kepada sp2 di sekeliling alfa-C, terdapat kumpulan keton yang terbentuk daripada kumpulan alkohol. Pembentukan ikatan berganda keton ini membolehkan resonans berlaku apabila elektron yang turun dari kumpulan karboksilat yang meninggalkan bergerak ke arah keton.

Penyahkarboksilan oksalosuksinat (di bawah tengah) ialah langkah utama dalam pembentukan alfa-ketoglutarat. Dalam tindak balas ini, pasangan tunggal di hidroksil tiroksina bersebelahan mengabstrak proton daripada kumpulan karboksil.[14] Kumpulan karboksil ini juga dirujuk sebagai subunit beta dalam molekul isositrat. Penyahprotonan kumpulan karboksil menyebabkan pasangan elektron tunggal bergerak ke bawah menjadikan karbon dioksida, dan berpisah daripada oksalosuksinat. Elektron terus bergerak ke arah karbon alfa lalu menolak elektron ikatan berganda (membuat keton) sehingga mengabstrak proton daripada sisa lisina bersebelahan. Ikatan berganda tak tepu alfa-beta terhasil antara karbon 2 dan 3. Seperti dalam gambar, ion hijau mewakili sama ada Mg2+ atau Mn2+, kofaktor yang diperlukan dalam tindak balas ini. Ion logam membentuk satu kompleks kecil melalui interaksi ionik dengan atom oksigen pada karbon keempat dan kelima (juga dikenali sebagai subunit gama isositrat).

Selepas karbon dioksida berpecah daripada oksalosuksinat dalam langkah penyahkarboksilan (di bawah kanan), enol akan mentautomer menjadi bentuk keto. Pembentukan ikatan berganda keton dimulakan dengan penyahprotonan oksigen daripada karbon alfa (C#2) oleh lisina yang sama yang memprotonkan oksigen pada awalnya.[14] Pasangan elektron tunggal bergerak ke bawah, menendang pasangan tunggal yang membuat ikatan ganda dua. Pasangan elektron tunggal ini mengabstrakkan proton daripada tirosina yang menyahprotonkan kumpulan karboksil dalam langkah penyahkarboksilan. Sebab kita boleh berkata bahawa sisa Lys dan Tyr adalah yang sama daripada langkah sebelumnya adalah kerana ia membantu dalam menahan molekul isositrat dalam tapak aktif enzim. Kedua-dua residu ini akan dapat membentuk ikatan hidrogen bolak-balik selagi ia cukup dekat dengan substrat.[4]

Langkah oksidoreduktase di mana NAD+ digunakan untuk menerima hidrida.[14]

Penyahkarboksilan oksalosuksinat[14]

Penepuan ikatan berganda tak tepu alfa-beta[14]

Enzim dehidrogenase isositrat seperti yang dinyatakan di atas menghasilkan alfa-ketoglutarat, karbon dioksida, dan NADH + H+ /NADPH + H+. Terdapat tiga perubahan yang berlaku sepanjang tindak balas. Pengoksidaan karbon 2, penyahkarboksilan (kehilangan karbon dioksida) daripada karbon 3, dan pembentukan kumpulan keton dengan perubahan stereokimia daripada sp3 kepada sp2.[14]

Isositrat dehidrogenase bergantungan NADP+ khinzir sebagai kompleks dengan Mn2+ dan isositrat. Pandangan permukaan poket tapak aktif di mana isositrat dibatasi oleh asid amino berkutub.[3]

Isositrat dehidrogenase bergantungan NADP+ khinzir sebagai kompleks dengan Mn2+ dan isositrat.[3]

Kompleks enzim khinzir; isositrat tapak aktif dan asid amino bersebelahan[3]

Tapak aktif

Kompleks IDH khinzir dengan Arg AA menstabilkan isositrat di tapak aktif. Sisa Arg110, Arg133, dan Arg101 ialah tiga asid amino penstabil utama. Ia membantu untuk memegang isositrat dalam tapak aktif dan dalam orientasi yang betul buat isositrat dehidrogenase.[3]

Struktur enzim isositrat dehidrogenase (IDH) dalam Escherichia coli ialah struktur ortolog IDH pertama yang dijelaskan dan difahami.[14] Sejak itu, struktur Escherichia coli IDH telah digunakan oleh kebanyakan penyelidik untuk membuat perbandingan dengan enzim isositrat dehidrogenase yang lain. Terdapat banyak pengetahuan terperinci tentang enzim bakteria ini, dan didapati bahawa kebanyakan dehidrogenase isositrat adalah serupa dalam struktur, dan oleh itu, juga dalam fungsi. Persamaan struktur dan fungsi ini memberikan alasan untuk mempercayai bahawa struktur itu dipelihara serta asid amino.[11] Oleh itu, tapak aktif dalam kalangan kebanyakan enzim dehidrogenase isositrat prokariot harus dipelihara juga, yang diperhatikan sepanjang banyak kajian yang dilakukan ke atas enzim prokariot. Enzim dehidrogenase isositrat eukariotik sebaliknya masih belum ditemui sepenuhnya. Setiap dimer IDH mempunyai dua tapak aktif.[14] Setiap tapak aktif mengikat molekul NAD+/NADP+ dan ion logam dwivalen (Mg2+, Mn2+). Secara amnya, setiap tapak aktif mempunyai urutan asid amino terpelihara untuk setiap tapak pengikatan tertentu. Dalam Desulfotalea psychrophila (IDH Dp)[14] dan babi (IDH Pc),[3] terdapat tiga substrat yang terikat pada tapak aktif.

1. Isositrat mengikat di dalam tapak aktif terhadap jujukan terpelihara kira-kira lapan asid amino melalui ikatan hidrogen. Asid ini termasuk (mungkin berbeza dalam sisa tetapi dengan sifat yang serupa) tirosina, serina, asparagina, arginina, arginina, arginina, tirosina dan lisina. Kedudukan mereka di tulang belakang berbeza-beza tetapi mereka semua berada dalam jarak dekat (iaitu Arg131 DpIDH dan Arg133 PcIDH, Tyr138 DpIDH dan Tyr140 PcIDH).[14]
2. Ion logam (Mg2+, Mn2+) mengikat terhadap tiga asid amino terpelihara melalui ikatan hidrogen. Asid amino ini termasuk tiga sisa aspartat.[14]
3. NAD+ dan NADP+ mengikat dalam tapak aktif dalam empat kawasan dengan sifat yang sama antara enzim IDH. Wilayah ini berbeza-beza tetapi adalah sekitar [250–260], [280–290], [300–330] dan [365–380]. Sekali lagi, kawasan berbeza-beza tetapi kedekatan kawasannya dipelihara.[14]